Forskerne har fået et fantastisk genetisk værktøj i form af CRISPR

/i , /af

Forskere fra hele verden har kastet sig over en relativ ny genteknologisk metode, den såkaldte CRISPR, som gør det nemt og billigt at klippe og klistre i gener.

Redigering af gener har altid fascineret forskere og aldrig har det været så billigt og nemt at redigere gensekvenser. Udvikling af redigering i gener startede i 1970’erne, hvor det blev muligt at manipulere DNA med enzymer. Styrede ændringer i DNA er bl.a. medvirkende til, at der er blevet udviklet ny medicin (1,2). I årtier har forskere indført ændringer i DNA’et i modelorganismer for at forstå funktionen af bestemte gener og f.eks finde ud af, hvilken rolle specifikke gener spiller for en specifik sygdom.

En organismes genom består af mil- liarder af fire DNA-baser, hvor rækkefølgen af disse baser bestemmer det genetiske udtryk. Stedsspecifikke ændringer i base- sekvensen giver enorme muligheder inden for molekylær biologi, medicin og bioteknologi. Forskerne kan simpelthen klippe og klistre i de humane gener efter forgodtbefindende. Alle kan være med.

Det er nemt og billigt. Fagre nye verden. Denne forskning er noget af det hotteste i øjeblikket (1,2,3).

I de seneste årtier er det gået utrolig hurtigt med redigering i gener. En af de nyeste metoder er CRISPR (udtales crisper), der er en forkortelse for Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats (1).

I et palindrom er DNA-base-sekvensen den samme, hvad enten man læser sekvensen fra den ene eller anden ende. Dette muliggør binding til begge DNA- strenge i mål-DNAét. Sammen med disse palindromiske repeats (gentagne sekvenser) anvendes et DNA-klippeenzym, en såkaldt endonuklease, som kan spalte DNA specifikke steder inde i DNA’et. Ofte anvendes Cas9, men der findes også andre egnede endonukleaser.

Små skridt ad gangen

Som så ofte før ligger der en masse forsøg og iagttagelser bag en ny teknik, inden forskerne får en idé om, hvordan tingene hænger sammen. Allerede i 1987 blev gentagne sekvenser, de såkaldte repeats, observeret i bakterier, men forskerne havde ingen idé om, hvilken rolle disse gentagne sekvenser spiller i bakterierne. I 2006 foreslog forskere, at disse repeats i bakterier havde noget at gøre med bakteriens forsvarssystem mod virus. I 2007 fandt man ud af, at en bakteries resistens over for specifikke virus skyldtes tilstedeværelse af særlige sekvenser mellem repeats i specifikke virus og bakteriens eget DNA , de såkaldte spacersekvenser (2).
I 2010 blev CRISPR/Cas9-systemet identificeret som værende et bakterielt immunsystem, hvormed bakterien kan angribe et virus og spalte dets DNA. For at dette kan fungere skulle der i bakterien være spacersekvenser mellem CRISPR- sekvenserne og bakteriens eget DNA, og man opdagede at disse spacersekvenser skulle matche DNA’et i virusset. Det blev også fundet, at man ved indsættelse af nye sekvenser i bakteriekromosomet, kunne få CRISPR/Cas9-systemet til at fungere som et adaptivt immunsystem (2). Dette var vigtig grundforskning på vejen til at udvikle CRISPR-teknikken.
I 2012 udkom en epokegørende artikel med Jennifer Doudna fra University of California, Berkley og Emmanuelle Charpentier fra Umeå University i Sverige som medforfattere (4). Forskerne påviste, at Cas9 er en endonuklease, der er i stand til at spalte begge DNA-strenge inde i en sekvens (derfor navnet endonuklease), og at specificiteten af denne proces er afhængig af komplementær binding af CRISPR-RNA/DNA til mål-DNA’et. Cas9 udviser 2 endonukleaseaktiviteter, som spalter hver deres komplementære DNA- streng. Princippet i CRISPR/Cas9 blev således påvist i 2012, men der var stadig mange trin før CRISPR-metoden var funktionsdygtig i levende celler.
Især Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier blev meget berømte for deres forskning. Men forsøgene var udført i reagensglas og ikke i celler.
Næste skridt var selvfølgelig at påvise, at CRISPR/Cas9 kunne fungere i levende celler. Zang og et forskerhold fra Broad Institute, MIT, publicerede i 2013, at de havde fået CRISPR til at virke ved redigering af genomet i dyrkede museceller og humane celler (5). En forskergruppe med deltagelse af ovennævnte Jennifer Doudna publicerede også i 2013, at CRISPR kunne bruges til at redigere DNA i humane celler (6). Der var kamp om at komme først med at få CRISPR til at virke i levende celler. Der var meget på spil ikke mindst økonomisk. CRISPR/Cas9- teknologien har gjort det billigt at ændre i gener. Førhen kostede det 100.000 kr at designe et protein, som kan klippe i DNA på en specifik måde. Med CRISPR/ Cas9 koster det kun 100 kr. Alle kan være med i CRISPR-kapløbet. Man behøver stort set kun almindeligt laboratorieudstyr og en RNA/DNA-sekvens, der kan guide endonukleasen til den ønskede position i mål-DNAét. Sådanne guidesekvenser kan findes i databaser over det humane genom. Det humane genom er klarlagt i alle detaljer i løbet af de seneste 10 år.
Men problemet er, at der klippes i mange andre gener end i det gen, man har til hensigt at ramme. Endonukleasen klipper, hvor sekvensen passer, uanset om det er et forkert sted. Herved opstår de såkaldte utilsigtede mutationer. Hvis man ikke kan lokalisere disse mutationer, kan det betyde, at sekvenserne der fører til mutationer, ikke kan korrigeres. Korrektion af forkerte sekvenser i DNA er ellers en procedure, som forskere i dag er rigtig gode til. Det virker både i enkeltceller i kultur og i organismer. Dette er således ikke problemet. Problemet er, at forskerne i dag ikke kan styre CRISPR-proceduren, hvorved der opstår rigtig mange celler, som ikke kan overleve. Denne celledød er i øjeblikket prisen for den manglende styring af CRISPR-proceduren. Nogle forskere har mere eller mindre opgivet at finde ud af, hvordan CRISPR virker (14). Vi bliver nødt til at leve med denne usikkerhed siger professor Luo og afprøve CRISPR i kliniske forsøg, hvor det afprøves på mennesker med en bestemt sygdom (14). Virker det, så er det godt for disse patienter, men det er ikke sikkert,1⁄2 at det virker på andre patienter med samme sygdom. Vi er nødt til at afprøve ny medicin på denne måde,
siger professor Luo (14). Mennesket er reduceret til at være et forsøgsdyr. Her står diskussionen i øjeblikket. Der er nu taget initiativ til at involvere alle, der har en mening om anvendelsen af CRISPR på mennesker (13). Denne artikel er mit bidrag til en diskussion i Danmark.

Forskere fra hele verden har kastet sig over en relativ ny genteknologisk metode, den såkaldte CRISPR, som gør det nemt og billigt at klippe og klistre i gener.

Hvordan virker CRISPR/ Cas9-systemet?

I laboratorieforsøg med CRISPR/Cas9 anvendes en RNA-guide eller DNA-guide til at genkende og binde til specifikke steder i et mål-gen, hvor der er et match mellem RNA-guiden og mål-DNA’et. I den oprindelige CRISPR-procedure blev RNA/ DNA-guiden udvalgt til at binde til begge strenge i den palindromiske sekvens i mål- DNAét. RNA/DNA-guidemolekylet kan udskiftes med en hvilken som helst RNA/
DNA-sekvens til påvisning af DNA, der kan bindes til dette RNA/DNA. Ved hjælp af oplysninger fra databaser over organismers genom, kan den ønskede sekvens findes, og der kan derefter foretages meget specifikke bindinger af RNA/DNA-guiden til mål-DNA’et, og dermed kan der udføres specifikke klip i DNA’et. Når DNA’et er klippet over med en endonuklease, som f.eks. Cas9, kan der tilføjes eller fjernes stykker af DNA’et, hvorved der sker en ændring af DNA-molekylet. Her kommer det store problem. Cellen har en mekanisme, der hurtigt lukker hullet. Dette sker ikke særlig præcist og der opstår hyppigt fejl.
CRISPR/Cas9-teknikken kan lyde avanceret, men metoden er faktisk langt nemmere og mere effektiv at anvende end tidligere gen-redigeringsteknikker. Desværre opstår der ofte utilsigtede mutationer.
Der har været ufattelig stor interesse for CRISPR/Cas9. Selv om teknikken kun er 6-7 år gammel, er der publiceret utallige videnskabelige artikler med relation til CRISPR.
De meget ansete tidsskrifter Nature og Science kårede i 2013 CRISPR/ Cas9-teknologien til at være blandt de mest betydningsfulde videnskabelige fremskridt i verden. Den bliver anset for at være det vigtigste genetiske værktøj siden opdagelsen af PCR-teknikken, som revolutionerede opformering af DNA-stykker. Dette førte til en hel ny verden af genteknologiske opdagelser (grundforskning) og opfindelser (anvendt forskning).
Men ligesom ved de tidligere genterapi- forsøg, kan der ske uventede genetiske ændringer ved CRISPR/Cas9. Man taler især om ”off-target” effekter, hvor den ønskede ændring f.eks. sker andre steder end der, hvor man havde planlagt det, og hvorved der kan opstå utilsigtede mutationer. I et omfattende studie fra 2017 var ”off-target”-effekter hovedformålet for studiet, for at kunne karakterisere utilsigtede mutationer (7). I studiet opstillede forskerne ved hjælp af gen-databaser en liste over 7444 publicerede hel-genom- sekvenser. Ud fra 30 sygdomsrelaterede DNA-sekvenser lavede man en liste med næsten 3000 sekvenser, som var kendte og havde været udvalgt som guide-RNA i CRISPR/Cas9 til styring af redigering i én af de 30 sygdomme. Herefter undersøgte forskerne, om nogle af de 7444 udvalgte ”normale” sekvenser havde en sekvens,
der afveg fra de forventede sekvenser kendt fra sygdomsrelaterede sekvenser. Forskerne fandt en række varianter, som i levende celler ville påvirke resultatet af et CRISPR/Cas9 relateret forsøg. Hvis disse varianter ligger i gener, der er vigtige for cellefunktioner, f.eks. tumorundertrykkende-gener, kan dette føre til kræft (7). Sådan kan forholdsvis simple metoder medvirke til kræftsygdom.

Mange forskere arbejder på at finde metoder til at løse problemet med utilsigtede mutationer. Sådanne løsninger vil antagelig kunne patenteres og være udgangspunkt for anvendt forskning.

Værktøjer til at undgå ”off- target”-effekter

Cas9-enzymet introducerer som sagt et brud i begge DNA-strenge. Dobbeltbrud i arvemassen er farligt for en celle, og cellen vil straks forsøge at reparere dobbeltbruddet. Ved denne proces kan der opstå mutationer, f.eks indsættelse eller fjernelse af DNA-baser i mål-DNA’et (8,10). En del af disse mutationer kan være fatale for cellen.
Japanske forskere har udviklet en modificeret Cas9, som kun laver brud i én af DNA-strengene. Med den modificerede Cas9 fremkaldte forskerne ét brud i mål- genet og ét i donor-DNA og kunne på denne måde styre ændringer i mål-genet på mere sikker måde (9). Med det modificerede Cas-enzym blev antallet af ”off-target”- hændelser i et forsøg nedsat fra 90% til 5% (9). Denne metode er nu meget udbredt. Der er også udviklet andre metoder, hvormed antallet af ”off-target”-hændelser kan nedsættes. Angrebsvinklerne er ret forskellige i et kapløb om at komme først med en sikker metode. Den første der indleverer en patentansøgning på opdagelsen, ville have de bedste kort på hånden, når patentrettigheder skal afklares om en del år senere. Det er
kendt, at patentbehandlingen bliver meget kompliceret, når opfindelser ligger tæt på hinanden.

En metode, der lokaliserer en utilsigtet mutation i humane gener vil være guld værd

Den 27. juli 2018 publicerede Richardsens forskningsgruppe ved University of California, Berkely, USA en metode til at lokalisere CRISPR-indsættelse af nye DNA-sekvenser i bestemte gener (3). Dette er en epokegørende opdagelse, da kendskabet til dette gør det muligt at lokalisere indsatte sekvenser i genomet. Når mutationen er fundet, har forskerne i mange år haft værktøjer til at rette sådanne mutationer. Men det forudsætter som sagt at man kan lokalisere mutationerne. Problemet med CRISPR opstår, fordi der ved den oprindelige CRISPR-metode kun lokaliseres et meget lille antal af de opståede mutationer, hvis man ikke lige forsker i et gen, hvis ukorrekte udtryk giver ophav til en bestemt sygdom.

I artiklen fra 27. juli 2018 beskriver Richardsen og kollegaer, hvordan det er lykkedes dem at afklare samspillet mellem CRISPR og en bestemt alvorlig og arvelig sygdom, nemlig ”Fanconi anæmi” (3). Fanconi anæmi-pathway involverer 21 gener, som alle er vigtige for at sygdommen kommer til udtryk (3). Opstår der en mutation i blot ét af disse gener, kan knoglemarven ikke danne nye blodlegemer. Med udnyttelse af beskrevne opdagelse kan mutationer i Fanconi anæmi korrigeres og sygdom undgås (3). Her bliver en opdagelse transformeret til anvendt forskning. CRISPR muliggør efter forskergruppens mening korrektion af uønskede mutationer i specifikke gener, der fører til sygdom, f. eks. kræft.

Anvendelser af CRISPR/Cas9- teknologien

Anvendelsesmulighederne af CRISPR/ Cas9 er mange, idet metoden er økonomisk favorabel, og metoden er nem og hurtig. Før anvendte forskerne relativt få typer af modelorganismer, såsom mus og bananfluer. Der har i lang tid været detaljerede procedurer til rådighed til udførelse af genetiske manipulationer i disse modeldyr.
I 2015 skete der noget, der skabte enorm debat. Her annoncerede kinesiske forskere, at de for første gang nogensinde havde modificeret gener i befrugtede humane æg (11). Når genmodifikation udføres på et befrugtet æg, medens det stadig er i enkeltcellestadiet, vil alle celler i det voksne individ have det modificerede arveanlæg, og ændringen vil nedarves. Utilsigtede bivirkninger vil dermed også nedarves.

Kinesernes forsøg med humane befrugtede æg påviste, at det hastede med regulativer på området. Der blev i medierne skrevet om, at designerbabyer snart var på vej. I december 2015 blev der afholdt et vigtigt regulatorisk møde i Washington D.C. med deltagelse af forskere og myndighedsrepræsentanter fra bl.a. USA, Kina og England for at diskutere etiske og videnskabelige problemer og muligheder for regulatoriske tiltag i relation til CRISPR-baseret genom-redigering i det humane genom.

Forskning i udnyttelse af CRISPR fortsatte, men kun på befrugtede æg/ fostre, der ikke var beregnet til implantering i en livmoder. Men blev denne grænse overholdt?

Perspektivering

Med CRISPR/Cas9-teknologien er det som sagt let at redigere gener i celler i kultur. Men metoder til gen-redigering af organismer er stadig under udvikling. Her er et af de store problemer at få det store Cas9-kompleks ind i kropsceller. CRISPR/ Cas9-komponenterne kan injiceres i celler i kultur eller der kan bruges andre kunstige metoder til at få CRISPR/Cas9- komponenterne ind i levende celler. Det siger sig selv, at sådanne metoder ikke kan anvendes til at ændre celler i organer. Der arbejdes også på at nedsætte størrelsen af Cas9-komplekset, så det er lettere at få dette kompleks transporteret ind i levende celler (10).

Det haster med en videnskabelig debat

De mange muligheder og den nemme adgang til ”opskrifter” på CRISPR- procedurer, er alt for farlig for os alle. Selv specialestuderende kan få vejledning (12). Kyndige personer må på en debatside, der netop er oprettet, deltage i alle aspekter af anvendelsen af CRISPR til redigering i det humane genom (13). Det kan ikke overlades til forskere og dem, der anvender forskningsresultaterne kommercielt, at diskutere, hvor grænserne er.

Kilder

  1. Roy, R.R. m.fl. (2018), Nature Biotechnology, ”Multiplexed precision genome editing with trackable genomic barcodes in yeast”, doi:10.1038/nbt.4137, omtalt i https://www.sciencedaily.com/ releases/2018/05/180508102209.htm
  2. Adli, M., (2018), Nature Communications, bd. 9, art.nr.: 1911, “The CRISPR tool kit for genome editing and beyond”, doi:10.1038/ s41467-018-04252-2
  3. Richardson, C.D. m.fl. (2018) Nature Genetics, 50 (8), 1132–1139, “ CRISPR-Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anæmi pathway”, doi:10.1038/s41588-018-0174-0
  4. Jinek, M. m.fl. (2012), Science, 337(6096), 816-21, “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”, doi:10.1126/science.1225829
  5. Ran F.A., m.fl., (2013) Nature Protoc, 8(11),2281-2308. “Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system”, doi: 10.1038/nprot.2013.143
    6.Jinek,M.,m.fl.(2013),eLife2013;2:e00471, “RNA-programmed genome editing in human cells”, doi:10.7554/eLife.00471
  6. Lessard, S., m.fl. (2017), Proc.Nat.Sci., 201714640, “Human genetic variation alters CRISPR-Cas9 on- and off-targeting specificity at therapeutically implicated loci”, doi:10.1073/pnas.1714640114
  7. Kosiski, M., m.fl. (2018), Nature Biotechnology, advance online publication, “Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangement”, doi:10.1038/ nbt.4192
  8. Nakajima,K., m.fl. (2018), Genome Res., 28(2), 223-230, ”Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair”, doi:10.1101/gr.226027.117
  9. Alejandro, C. m.fl. (2018), Proc Nat Acad Sci, 201718148, ”Precise Cas9 targeting enables genomic mutation prevention”, doi: 10.1073/pnas.1718148115
  10. Liang, P., m.fl., (2015), Protein and Cell 5 (6), 363-372, “CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes”, doi:10.1007/s13238-015-0153-5
    12).Thurttle-Schmidt, D.M. & Lo, Te-Wen (2018), Topical Review 46(2), 195-205, “Molecular Biology at the Cutting Edge: A review on CRISPR/Cas9 Gene Editing for Undergraduates”, doi:10.1002/bmb.21108
  11. Willis, T. (2018):” CRISPR – A New Era in Genome Editing”, The Science Advisory Board, https://www.scienceboard.net/index. aspx?sec=log&itemID=9
  12. Luo, J. (2018), “Here’s what we know about CRISPR safety – and reports of
    ”genome vandalism”, artiklen blev oprindelig publiceret på http://theconversation.com/ heres-what-we-know-about-crispr-safety- and-reports-of-genome-vandalism-100231; original artikel: https//livescience. com/63260-crispr-safety.html