Forskerne har fået et fantastisk genetisk værktøj i form af CRISPR

/i , /af

Forskere fra hele verden har kastet sig over en relativ ny genteknologisk metode, den såkaldte CRISPR, som gør det nemt og billigt at klippe og klistre i gener.

Redigering af gener har altid fascineret forskere og aldrig har det været så billigt og nemt at redigere gensekvenser. Udvikling af redigering i gener startede i 1970’erne, hvor det blev muligt at manipulere DNA med enzymer. Styrede ændringer i DNA er bl.a. medvirkende til, at der er blevet udviklet ny medicin (1,2). I årtier har forskere indført ændringer i DNA’et i modelorganismer for at forstå funktionen af bestemte gener og f.eks finde ud af, hvilken rolle specifikke gener spiller for en specifik sygdom.

En organismes genom består af mil- liarder af fire DNA-baser, hvor rækkefølgen af disse baser bestemmer det genetiske udtryk. Stedsspecifikke ændringer i base- sekvensen giver enorme muligheder inden for molekylær biologi, medicin og bioteknologi. Forskerne kan simpelthen klippe og klistre i de humane gener efter forgodtbefindende. Alle kan være med.

Det er nemt og billigt. Fagre nye verden. Denne forskning er noget af det hotteste i øjeblikket (1,2,3).

I de seneste årtier er det gået utrolig hurtigt med redigering i gener. En af de nyeste metoder er CRISPR (udtales crisper), der er en forkortelse for Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats (1).

I et palindrom er DNA-base-sekvensen den samme, hvad enten man læser sekvensen fra den ene eller anden ende. Dette muliggør binding til begge DNA- strenge i mål-DNAét. Sammen med disse palindromiske repeats (gentagne sekvenser) anvendes et DNA-klippeenzym, en såkaldt endonuklease, som kan spalte DNA specifikke steder inde i DNA’et. Ofte anvendes Cas9, men der findes også andre egnede endonukleaser.

Små skridt ad gangen

Som så ofte før ligger der en masse forsøg og iagttagelser bag en ny teknik, inden forskerne får en idé om, hvordan tingene hænger sammen. Allerede i 1987 blev gentagne sekvenser, de såkaldte repeats, observeret i bakterier, men forskerne havde ingen idé om, hvilken rolle disse gentagne sekvenser spiller i bakterierne. I 2006 foreslog forskere, at disse repeats i bakterier havde noget at gøre med bakteriens forsvarssystem mod virus. I 2007 fandt man ud af, at en bakteries resistens over for specifikke virus skyldtes tilstedeværelse af særlige sekvenser mellem repeats i specifikke virus og bakteriens eget DNA , de såkaldte spacersekvenser (2).
I 2010 blev CRISPR/Cas9-systemet identificeret som værende et bakterielt immunsystem, hvormed bakterien kan angribe et virus og spalte dets DNA. For at dette kan fungere skulle der i bakterien være spacersekvenser mellem CRISPR- sekvenserne og bakteriens eget DNA, og man opdagede at disse spacersekvenser skulle matche DNA’et i virusset. Det blev også fundet, at man ved indsættelse af nye sekvenser i bakteriekromosomet, kunne få CRISPR/Cas9-systemet til at fungere som et adaptivt immunsystem (2). Dette var vigtig grundforskning på vejen til at udvikle CRISPR-teknikken.
I 2012 udkom en epokegørende artikel med Jennifer Doudna fra University of California, Berkley og Emmanuelle Charpentier fra Umeå University i Sverige som medforfattere (4). Forskerne påviste, at Cas9 er en endonuklease, der er i stand til at spalte begge DNA-strenge inde i en sekvens (derfor navnet endonuklease), og at specificiteten af denne proces er afhængig af komplementær binding af CRISPR-RNA/DNA til mål-DNA’et. Cas9 udviser 2 endonukleaseaktiviteter, som spalter hver deres komplementære DNA- streng. Princippet i CRISPR/Cas9 blev således påvist i 2012, men der var stadig mange trin før CRISPR-metoden var funktionsdygtig i levende celler.
Især Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier blev meget berømte for deres forskning. Men forsøgene var udført i reagensglas og ikke i celler.
Næste skridt var selvfølgelig at påvise, at CRISPR/Cas9 kunne fungere i levende celler. Zang og et forskerhold fra Broad Institute, MIT, publicerede i 2013, at de havde fået CRISPR til at virke ved redigering af genomet i dyrkede museceller og humane celler (5). En forskergruppe med deltagelse af ovennævnte Jennifer Doudna publicerede også i 2013, at CRISPR kunne bruges til at redigere DNA i humane celler (6). Der var kamp om at komme først med at få CRISPR til at virke i levende celler. Der var meget på spil ikke mindst økonomisk. CRISPR/Cas9- teknologien har gjort det billigt at ændre i gener. Førhen kostede det 100.000 kr at designe et protein, som kan klippe i DNA på en specifik måde. Med CRISPR/ Cas9 koster det kun 100 kr. Alle kan være med i CRISPR-kapløbet. Man behøver stort set kun almindeligt laboratorieudstyr og en RNA/DNA-sekvens, der kan guide endonukleasen til den ønskede position i mål-DNAét. Sådanne guidesekvenser kan findes i databaser over det humane genom. Det humane genom er klarlagt i alle detaljer i løbet af de seneste 10 år.
Men problemet er, at der klippes i mange andre gener end i det gen, man har til hensigt at ramme. Endonukleasen klipper, hvor sekvensen passer, uanset om det er et forkert sted. Herved opstår de såkaldte utilsigtede mutationer. Hvis man ikke kan lokalisere disse mutationer, kan det betyde, at sekvenserne der fører til mutationer, ikke kan korrigeres. Korrektion af forkerte sekvenser i DNA er ellers en procedure, som forskere i dag er rigtig gode til. Det virker både i enkeltceller i kultur og i organismer. Dette er således ikke problemet. Problemet er, at forskerne i dag ikke kan styre CRISPR-proceduren, hvorved der opstår rigtig mange celler, som ikke kan overleve. Denne celledød er i øjeblikket prisen for den manglende styring af CRISPR-proceduren. Nogle forskere har mere eller mindre opgivet at finde ud af, hvordan CRISPR virker (14). Vi bliver nødt til at leve med denne usikkerhed siger professor Luo og afprøve CRISPR i kliniske forsøg, hvor det afprøves på mennesker med en bestemt sygdom (14). Virker det, så er det godt for disse patienter, men det er ikke sikkert,1⁄2 at det virker på andre patienter med samme sygdom. Vi er nødt til at afprøve ny medicin på denne måde,
siger professor Luo (14). Mennesket er reduceret til at være et forsøgsdyr. Her står diskussionen i øjeblikket. Der er nu taget initiativ til at involvere alle, der har en mening om anvendelsen af CRISPR på mennesker (13). Denne artikel er mit bidrag til en diskussion i Danmark.

Forskere fra hele verden har kastet sig over en relativ ny genteknologisk metode, den såkaldte CRISPR, som gør det nemt og billigt at klippe og klistre i gener.

Hvordan virker CRISPR/ Cas9-systemet?

I laboratorieforsøg med CRISPR/Cas9 anvendes en RNA-guide eller DNA-guide til at genkende og binde til specifikke steder i et mål-gen, hvor der er et match mellem RNA-guiden og mål-DNA’et. I den oprindelige CRISPR-procedure blev RNA/ DNA-guiden udvalgt til at binde til begge strenge i den palindromiske sekvens i mål- DNAét. RNA/DNA-guidemolekylet kan udskiftes med en hvilken som helst RNA/
DNA-sekvens til påvisning af DNA, der kan bindes til dette RNA/DNA. Ved hjælp af oplysninger fra databaser over organismers genom, kan den ønskede sekvens findes, og der kan derefter foretages meget specifikke bindinger af RNA/DNA-guiden til mål-DNA’et, og dermed kan der udføres specifikke klip i DNA’et. Når DNA’et er klippet over med en endonuklease, som f.eks. Cas9, kan der tilføjes eller fjernes stykker af DNA’et, hvorved der sker en ændring af DNA-molekylet. Her kommer det store problem. Cellen har en mekanisme, der hurtigt lukker hullet. Dette sker ikke særlig præcist og der opstår hyppigt fejl.
CRISPR/Cas9-teknikken kan lyde avanceret, men metoden er faktisk langt nemmere og mere effektiv at anvende end tidligere gen-redigeringsteknikker. Desværre opstår der ofte utilsigtede mutationer.
Der har været ufattelig stor interesse for CRISPR/Cas9. Selv om teknikken kun er 6-7 år gammel, er der publiceret utallige videnskabelige artikler med relation til CRISPR.
De meget ansete tidsskrifter Nature og Science kårede i 2013 CRISPR/ Cas9-teknologien til at være blandt de mest betydningsfulde videnskabelige fremskridt i verden. Den bliver anset for at være det vigtigste genetiske værktøj siden opdagelsen af PCR-teknikken, som revolutionerede opformering af DNA-stykker. Dette førte til en hel ny verden af genteknologiske opdagelser (grundforskning) og opfindelser (anvendt forskning).
Men ligesom ved de tidligere genterapi- forsøg, kan der ske uventede genetiske ændringer ved CRISPR/Cas9. Man taler især om ”off-target” effekter, hvor den ønskede ændring f.eks. sker andre steder end der, hvor man havde planlagt det, og hvorved der kan opstå utilsigtede mutationer. I et omfattende studie fra 2017 var ”off-target”-effekter hovedformålet for studiet, for at kunne karakterisere utilsigtede mutationer (7). I studiet opstillede forskerne ved hjælp af gen-databaser en liste over 7444 publicerede hel-genom- sekvenser. Ud fra 30 sygdomsrelaterede DNA-sekvenser lavede man en liste med næsten 3000 sekvenser, som var kendte og havde været udvalgt som guide-RNA i CRISPR/Cas9 til styring af redigering i én af de 30 sygdomme. Herefter undersøgte forskerne, om nogle af de 7444 udvalgte ”normale” sekvenser havde en sekvens,
der afveg fra de forventede sekvenser kendt fra sygdomsrelaterede sekvenser. Forskerne fandt en række varianter, som i levende celler ville påvirke resultatet af et CRISPR/Cas9 relateret forsøg. Hvis disse varianter ligger i gener, der er vigtige for cellefunktioner, f.eks. tumorundertrykkende-gener, kan dette føre til kræft (7). Sådan kan forholdsvis simple metoder medvirke til kræftsygdom.

Mange forskere arbejder på at finde metoder til at løse problemet med utilsigtede mutationer. Sådanne løsninger vil antagelig kunne patenteres og være udgangspunkt for anvendt forskning.

Værktøjer til at undgå ”off- target”-effekter

Cas9-enzymet introducerer som sagt et brud i begge DNA-strenge. Dobbeltbrud i arvemassen er farligt for en celle, og cellen vil straks forsøge at reparere dobbeltbruddet. Ved denne proces kan der opstå mutationer, f.eks indsættelse eller fjernelse af DNA-baser i mål-DNA’et (8,10). En del af disse mutationer kan være fatale for cellen.
Japanske forskere har udviklet en modificeret Cas9, som kun laver brud i én af DNA-strengene. Med den modificerede Cas9 fremkaldte forskerne ét brud i mål- genet og ét i donor-DNA og kunne på denne måde styre ændringer i mål-genet på mere sikker måde (9). Med det modificerede Cas-enzym blev antallet af ”off-target”- hændelser i et forsøg nedsat fra 90% til 5% (9). Denne metode er nu meget udbredt. Der er også udviklet andre metoder, hvormed antallet af ”off-target”-hændelser kan nedsættes. Angrebsvinklerne er ret forskellige i et kapløb om at komme først med en sikker metode. Den første der indleverer en patentansøgning på opdagelsen, ville have de bedste kort på hånden, når patentrettigheder skal afklares om en del år senere. Det er
kendt, at patentbehandlingen bliver meget kompliceret, når opfindelser ligger tæt på hinanden.

En metode, der lokaliserer en utilsigtet mutation i humane gener vil være guld værd

Den 27. juli 2018 publicerede Richardsens forskningsgruppe ved University of California, Berkely, USA en metode til at lokalisere CRISPR-indsættelse af nye DNA-sekvenser i bestemte gener (3). Dette er en epokegørende opdagelse, da kendskabet til dette gør det muligt at lokalisere indsatte sekvenser i genomet. Når mutationen er fundet, har forskerne i mange år haft værktøjer til at rette sådanne mutationer. Men det forudsætter som sagt at man kan lokalisere mutationerne. Problemet med CRISPR opstår, fordi der ved den oprindelige CRISPR-metode kun lokaliseres et meget lille antal af de opståede mutationer, hvis man ikke lige forsker i et gen, hvis ukorrekte udtryk giver ophav til en bestemt sygdom.

I artiklen fra 27. juli 2018 beskriver Richardsen og kollegaer, hvordan det er lykkedes dem at afklare samspillet mellem CRISPR og en bestemt alvorlig og arvelig sygdom, nemlig ”Fanconi anæmi” (3). Fanconi anæmi-pathway involverer 21 gener, som alle er vigtige for at sygdommen kommer til udtryk (3). Opstår der en mutation i blot ét af disse gener, kan knoglemarven ikke danne nye blodlegemer. Med udnyttelse af beskrevne opdagelse kan mutationer i Fanconi anæmi korrigeres og sygdom undgås (3). Her bliver en opdagelse transformeret til anvendt forskning. CRISPR muliggør efter forskergruppens mening korrektion af uønskede mutationer i specifikke gener, der fører til sygdom, f. eks. kræft.

Anvendelser af CRISPR/Cas9- teknologien

Anvendelsesmulighederne af CRISPR/ Cas9 er mange, idet metoden er økonomisk favorabel, og metoden er nem og hurtig. Før anvendte forskerne relativt få typer af modelorganismer, såsom mus og bananfluer. Der har i lang tid været detaljerede procedurer til rådighed til udførelse af genetiske manipulationer i disse modeldyr.
I 2015 skete der noget, der skabte enorm debat. Her annoncerede kinesiske forskere, at de for første gang nogensinde havde modificeret gener i befrugtede humane æg (11). Når genmodifikation udføres på et befrugtet æg, medens det stadig er i enkeltcellestadiet, vil alle celler i det voksne individ have det modificerede arveanlæg, og ændringen vil nedarves. Utilsigtede bivirkninger vil dermed også nedarves.

Kinesernes forsøg med humane befrugtede æg påviste, at det hastede med regulativer på området. Der blev i medierne skrevet om, at designerbabyer snart var på vej. I december 2015 blev der afholdt et vigtigt regulatorisk møde i Washington D.C. med deltagelse af forskere og myndighedsrepræsentanter fra bl.a. USA, Kina og England for at diskutere etiske og videnskabelige problemer og muligheder for regulatoriske tiltag i relation til CRISPR-baseret genom-redigering i det humane genom.

Forskning i udnyttelse af CRISPR fortsatte, men kun på befrugtede æg/ fostre, der ikke var beregnet til implantering i en livmoder. Men blev denne grænse overholdt?

Perspektivering

Med CRISPR/Cas9-teknologien er det som sagt let at redigere gener i celler i kultur. Men metoder til gen-redigering af organismer er stadig under udvikling. Her er et af de store problemer at få det store Cas9-kompleks ind i kropsceller. CRISPR/ Cas9-komponenterne kan injiceres i celler i kultur eller der kan bruges andre kunstige metoder til at få CRISPR/Cas9- komponenterne ind i levende celler. Det siger sig selv, at sådanne metoder ikke kan anvendes til at ændre celler i organer. Der arbejdes også på at nedsætte størrelsen af Cas9-komplekset, så det er lettere at få dette kompleks transporteret ind i levende celler (10).

Det haster med en videnskabelig debat

De mange muligheder og den nemme adgang til ”opskrifter” på CRISPR- procedurer, er alt for farlig for os alle. Selv specialestuderende kan få vejledning (12). Kyndige personer må på en debatside, der netop er oprettet, deltage i alle aspekter af anvendelsen af CRISPR til redigering i det humane genom (13). Det kan ikke overlades til forskere og dem, der anvender forskningsresultaterne kommercielt, at diskutere, hvor grænserne er.

Kilder

  1. Roy, R.R. m.fl. (2018), Nature Biotechnology, ”Multiplexed precision genome editing with trackable genomic barcodes in yeast”, doi:10.1038/nbt.4137, omtalt i https://www.sciencedaily.com/ releases/2018/05/180508102209.htm
  2. Adli, M., (2018), Nature Communications, bd. 9, art.nr.: 1911, “The CRISPR tool kit for genome editing and beyond”, doi:10.1038/ s41467-018-04252-2
  3. Richardson, C.D. m.fl. (2018) Nature Genetics, 50 (8), 1132–1139, “ CRISPR-Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anæmi pathway”, doi:10.1038/s41588-018-0174-0
  4. Jinek, M. m.fl. (2012), Science, 337(6096), 816-21, “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”, doi:10.1126/science.1225829
  5. Ran F.A., m.fl., (2013) Nature Protoc, 8(11),2281-2308. “Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system”, doi: 10.1038/nprot.2013.143
    6.Jinek,M.,m.fl.(2013),eLife2013;2:e00471, “RNA-programmed genome editing in human cells”, doi:10.7554/eLife.00471
  6. Lessard, S., m.fl. (2017), Proc.Nat.Sci., 201714640, “Human genetic variation alters CRISPR-Cas9 on- and off-targeting specificity at therapeutically implicated loci”, doi:10.1073/pnas.1714640114
  7. Kosiski, M., m.fl. (2018), Nature Biotechnology, advance online publication, “Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangement”, doi:10.1038/ nbt.4192
  8. Nakajima,K., m.fl. (2018), Genome Res., 28(2), 223-230, ”Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair”, doi:10.1101/gr.226027.117
  9. Alejandro, C. m.fl. (2018), Proc Nat Acad Sci, 201718148, ”Precise Cas9 targeting enables genomic mutation prevention”, doi: 10.1073/pnas.1718148115
  10. Liang, P., m.fl., (2015), Protein and Cell 5 (6), 363-372, “CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes”, doi:10.1007/s13238-015-0153-5
    12).Thurttle-Schmidt, D.M. & Lo, Te-Wen (2018), Topical Review 46(2), 195-205, “Molecular Biology at the Cutting Edge: A review on CRISPR/Cas9 Gene Editing for Undergraduates”, doi:10.1002/bmb.21108
  11. Willis, T. (2018):” CRISPR – A New Era in Genome Editing”, The Science Advisory Board, https://www.scienceboard.net/index. aspx?sec=log&itemID=9
  12. Luo, J. (2018), “Here’s what we know about CRISPR safety – and reports of
    ”genome vandalism”, artiklen blev oprindelig publiceret på http://theconversation.com/ heres-what-we-know-about-crispr-safety- and-reports-of-genome-vandalism-100231; original artikel: https//livescience. com/63260-crispr-safety.html

Celledød er en del af livet

/i /af

Nogle celler i et individ dømmes til at dø for at andre celler kan overleve.

Nogle celler skal dø, fordi der skal ske ændringer i andre celler eller væv i et individ. Celledød er en del af livet. Døde celler bliver fjernet af immunsystemet, eller indhold fra cellerne bliver brugt som byggesten for andre celler. Den mest almindelige celledød er apoptose, som er en naturligt programmeret (planlagt) celledød.

Apoptose har flere funktioner, hvor denførste rolle er i fosterudviklingen. Apoptose er med til at forme organer og er f.eks.afgørende for dannelse af fingre og tæer i fosteret, da hudceller mellem fingre og tæer må nedbrydes, for at hænder og fødder bliver funktionelle. Apoptose finder også sted i de fleste organer og væv i det voksne individ Apoptose er et selvmordsprogram, som kan aktiveres enten direkte, ved at cellen påvirkes af bestemte signalmolekyler, eller indirekte, ved at cellen ikke modtager signaler, som undertrykker aktivering af apoptose Manglende signaler opfattes som et udtryk for, at cellen ikke længere behøves, hvorefter cellen eliminerer sig selv.

Celledød kan fremkaldes på flere forskellige måder

Ud over den ovenfor omtalte apoptose kan cellerne f.eks. dø ved nekrose, autofagi (selv-fortæring), eller ved den nyligt opdagede ferroptose. Nekrose er en form for celleskade, der resulterer i død af celler i levende væv ved autolyse. Nekrose skyldes faktorer uden for cellen eller vævet, såsom infektion, toksiner eller traumer, der resulterer i nedbrydning af cellekomponenter. Rundt om nekrosen vil der være en inflammation, da immunforsvaret forsøger at mindske skaderne og fjerne resterne af de døde og døende celler.

Autofagi er cellens renovationsmekanisme. Ved processen afgrænser cellen nogle af sine egne bestanddele og nedbryder dem derefter ved hjælp af fordøjelsesenzymer fra lysosomerne. Man kan kalde autofagi en omdirigering af cellens byggesten til de steder i kroppen, der har mest brug for byggesten til at opbygge makromolekyler. I forhold til udvikling af kræft har renovationssystemet to funktioner. Det bidrager til at holde cellerne raske og forhindrer, at der opstår kræft, og det har dermed en beskyttende effekt mod kræft. Men opstår der kræft, kan kræftcellerne bruge renovationssystemet til at skaffe sig byggesten til at opbygge makromolekyler, såsom DNA, RNA og protein.

Ferroptose

Ferroptose er en form for reguleret celledød, som er karakteriseret ved jern-afhængig akkumulering af lipidhydroperoxider til niveauer, som er dødelige for cellen. Celledød ved ferroptose kan undertrykkes med jernbindende molekyler, såkaldte chelatorer, med lipofile antioxidanter og med hæmmere af lipidoxidation (1) Ferroptose er tæt koblet til talrige biologiske processer, herunder omsætning af aminosyrer, jern og polyumættede fedtsyrer samt biosyntese af glutathion, phospholipider, NADPH og coenzym Q10 (1). Ferroptose sættes i forbindelse med patologisk celledød relateret til degenerative sygdomme, f.eks. Alzheimer, Huntingtons sygdom, Parkinsons sygdom, kræft, slagtilfælde, intracerebral blødning, traumatisk skade på hjernen, lokal blodmangel/genoprettelse af blodtilførsel samt nyre-degeneration (1). Reference (1), der blev publiceret i slutningen af 2017, er en meget grundig gennemgang af det hurtigt voksende forskningsfelt omkring ferroptose. Artiklen omtaler over 100 forskningsartikler og er forfattet af en stor international forskergruppe.

Ferroptose blev opdaget for nylig

Det er kun 5 år siden, at celledød ved ferroptose blev beskrevet (2). Forskerne havde hæmmet et transportørprotein, som transporterer cystein ind i celler til brug ved syntese af proteiner, især biosyntese af glutathion. Uden cystein bliver proteinsyntesen hæmmet, og cellen dør. Denne gruppe af forskere fandt også ud af, det glutathion-afhængige enzym, glutathionperoxidase 4 (GPX4) havde betydning for ferroptose (2).

Hvordan kan man undersøge betydningen af GPX4 og ferroptose?

Når man vil undersøge, hvor vigtig et enzym er for en celles overlevelse, benytter man ofte et modeldyr, hvor det gen, der koder for enzymet, er defekt, således at enzymet ikke fungerer. Hvis genet, der koder for GPX4 ødelægges i mus, er det fatalt i tidlig fostertilstand (3). Hvis man vil undersøge funktionen af GPX4 hos voksne mus, må man derfor frembringe en inducerbar tilstand, hvor GPX4 fungerer i fostertilstanden, men ikke kan bringes i en funktionel tilstand i det voksne individ, og musen overlever ikke til voksenstadiet (3). I sådanne forsøg viste det sig, at musene uden GPX4 døde efter 2 uger. Det første der sker, når GPX4 ikke er funktionel, er, at cardiolipin og andre phospholipider oxideres (3). Her adskiller celledød ved ferroptose sig fra celledød ved apoptose. Morfologien af de døde celler er også meget forskellig fra morfologien af celler, der er døde ved apoptose eller nekrose. En celle, de er død ved ferroptose, skumper ind, og mitokondrierne er skadet, medens kernen er intakt. Disse træk er unikke for ferroptose. En celle, der er død ved apoptose, udviser fragmentering af kromosomerne. En celle, der er død ved nekrose, svulmer op (1).

En celle, de er død ved ferroptose, skumper ind, og mitokondrierne er skadet, medens kernen er intakt. Disse træk er unikke for ferroptose. En celle, der er død ved apoptose, udviser fragmentering af kromosomerne. En celle, der er død ved nekrose, svulmer op (1).

Hvordan virker ferroptose?

Ferroptose kan blive udløst af små molekyler eller tilstande, hvor biosyntesen af glutathion er hæmmet eller hvor det glutathion-afhængige antioxiderende enzym glutathionperoxidase 4 (GPX4) er hæmmet (1). GPX4 kræver selen for at virke. Det har vist sig, at mangel på selen øger ferroptotiske processer. Reduktion af GPX4-aktiviteten øger i det hele taget ferroptose (4,5,6).

Glutathionperoxidase 4

Glutathionperoxidase 4 (GPX4) er et enzym, der reducerer peroxidaser, hvorved der samtidig sker en oxidation af glutathion. GPX4 omdanner potentielt toksiske hydroperoxider til ikke-toksiske lipidalkoholer. Hvis GPX4 inaktiveres, sker der en stor lipidoxidation, og cellen dør (1). Glutathionperoxidase er som sagt et selenholdigt protein, hvor det svovlholdige cystein i position 21 er udskiftet med et selenholdigt cystein.

Selen er et essentielt sporstof for mennesker

Det er 200 år siden, at svenskeren Jøns Jakob Berzelius opdagede sporelementet selen. Selen er et essentielt sporstof for mennesker, mange dyr og nogle bakterier. For nyligt har en tysk forskergruppe under ledelse af Marcus Conrad, for første gang vist, hvorfor selen er en begrænsende faktor for pattedyr (7). Denne forskergruppe har studeret ferroptose i flere år og havde kendskab til, at enzymet GPX4 indeholdt selenocystein i modsætning til normalt cystein, der indeholder svovl. Men hvorfor var det så vigtigt, og hvad effekten af at udskifte svovlholdig cystein med selenholdig cystein?

Der findes en lang række hæmmere af ferroptose, som på sigt har et potentiale til at blive udviklet til behandling af en række degenerative sygdomme, f.eks. Alzheimer, Huntingtons sygdom, Parkinsons sygdom, kræft, slagtilfælde, intracerebral blødning, traumatisk skade på hjernen, lokal blodmangel/ genoprettelse af blodtilførsel samt nyre-degeneration.

Marcus Conrads forskergruppe brugte flere musemodeller i deres studier. I én af modellerne indeholdt GPX4 svovlholdig cystein i stedet for selenholdig cystein. Disse mus overlevede ikke 3 uger, fordi de fik neurologiske problemer (7). Marcus Conrads forskergruppe identificerede en undergruppe af specialiserede neuroner i hjernen, som ikke var tilstede, hvis musene manglede selenholdig GPX4. Disse neuroner forsvandt under fosterudviklingen efter fødslen, når der var selenholdigt GPX4 tilstede i stedet for svovlholdig GPX4. Forskerne påviste også, at ferroptose blev igangsat ved oxidativ stress. Oxidativ stress forekommer f.eks., hvis der er høj metabolisk aktivitet. Det er første gang, at det er vist, hvorfor selen er en essentiel faktor for udvikling af en specifik type af neuroner, de såkaldte interneuroner, under fosterudviklingen efter fødslen. Selenholdig GPX4 beskytter disse specialiserede neuroner mod oxidativ stress og mod ferroptotisk død (7). Inkorporering af selenholdig cystein i GPX4 er bemærkelsesværdigt, da processen, der fører til selenholdig GPX4, er meget kompleks og koster rigtig meget energi for cellen (7). Det tyder på, at cellen har visse fordele ved at udskifte det normale svovlholdige cystein i GPX4 med selenholdig cystein. Nogle forskere har en teori om, at selenholdig GPX4 er mere modstandsdygtig over for kraftig oxidation (7). Endvidere er der fremsat en hypotese om, at der har været et evolutionært pres for at bevare GPX4 med selenocystein for at kunne opfylde et krav om, at mængden af polyumættede fedtsyrer, som bl.a. indgår i cellemembraner, er forøget på grund af mindre oxidation (7). Når mængden af polyumættede fedtsyrer stiger, bliver cellemembraner mere flydende, og cellerne kan nemmere tilpasse sig til forskellige tilstande, f.eks forskellige temperaturer (1).

Perspektivering

Den nye viden om ferroptose giver nye angrebsvinkler for udvikling af medicin. Kontrol af ferroptose kan f.eks. opnås ved regulering af jernmetabolismen. Det er kendt, at jern i hjernen stiger med alderen ligesom degenerative sygdomme er hyppigere hos ældre. Stigningen i jern kan bidrage til en aldersafhængig risiko for ferroptoseproblemer og degenerative problemer (1). Der findes en lang række hæmmere af ferroptose, som på sigt har et potentiale til at blive udviklet til behandling af en række degenerative sygdomme, f.eks. Alzheimer, Huntingtons sygdom, Parkinsons sygdom, kræft, slagtilfælde, intracerebral blødning, traumatisk skade på hjernen, lokal blodmangel/genoprettelse af blodtilførsel samt nyre-degeneration (1).

Kilder

  1. Stockwell, B.R., m.fl. (2017), Cell, 171, 273-285, ”Ferroptosis: a regulated cell death nexus linking metabolism, redox biology and disease”, doi:10.1016/j. cell.2017.09.021
  2. Dixon, S.J. m.fl. (2012), Cell, 149(5), 1060-1072, “Ferroptosis: an irondependent form of non-apoptotic cell death”, doi:10.1016/j.cell.2012.03.042
  3. Conrad, M. & Angell, J.P.F. (2015), Molecular & Cellular Oncology, 2:3, e995047, “Glutathione peroxidase 4 (GPX4) and ferroptosis: what’s so special about it?”, doi:10.4161/23723556.2014.9 95047
  4. Yu, H. m.fl. (2017), J. Cell. Med., 21(4), 648-657, “Ferroptosis, a new form of cell death, and its relationships with tumourous diseases”, doi:10.1111/jcmm.13008
  5. Cardoso, B.R. m. fl. (2017), Mol. Psychiatry, 22(3), 328-335, “Gluthione peroxidase 4: a new player in neurodegeneration?”, doi:10.1038/mp.2016.196
  6. Cao, J.Y. & Dixon J. S. (2016), Cell Mol Life Sci, 73, 2195-2209, “Mechanisms of ferroptosis”, doi10.1007/s0018-016-2194-1
  7. Ingold, I. m.fl. (2018), Cell, 172, 1-14, “Selenium Utilization by GPX4 Is Required to Prevent Hydroperoxide-Induced Ferroptosis.”, doi: 10.1016/j.cell.2017.11.048

Forskellige kræfttyper kan nu påvises tidligt i én blodprøve og kan lokaliseres i kroppen

/i /af

Med den nye CancerSEEK-metode kan kræft spores meget tidligt. Dette giver mulighed for behandling, inden kræften danner metastaser.

Kræft kan være vanskeligt at opdage, inden metastaser fra tumoren har spredt sig til andre dele af kroppen. Forskere har i de seneste år ledt efter metoder til at påvise fortsættes næste side… kræft på et tidligt tidspunkt, hvor kræften kun er lokaliseret i det organ, hvor sygdommen startede. Nu har en stor international forskergruppe udviklet en metode til at påvise almindelige kræfttyper på et tidligt tidspunkt, inden kræften har spredt sig og stadig kan fjernes ved operation (1). Den nye epokegørende metode kan med én blodprøve påvise og lokalisere kræft i 8 organer, nemlig æggestok, lever, mave, bugspytkirtel, spiserøret, endetarmen, lunger eller bryst (1). Disse kræfttyper udgør over 60% af kræftdødsfald i USA. For 5 af disse kræfttyper findes ingen screeningsanalyse, nemlig kræft i æggestok, lever, mave, bugspytkirtel og spiserør. Udvikling af en test af en blodprøve, en såkaldt flydende biopsi, i stedet for vævsbiopsi, har medvirket til at dette forskningsfelt er vokset kolossalt de sidste par år.

Flydende biopsier

Test af flydende biopsier i blod bygger på store fremskridt inden for sekvensbestemmelse af det humane genom, idet der nu kan påvises genetiske mutationer i kræftrelateret DNA, som stammer fra kræftceller, selvom der kun er små mængder til stede i blodet. Det har vist sig, at unikke kræftmutationer kan påvises i mikroskopiske fragmenter af kræftrelateret DNA i en patients blod (2). Når kræftrelateret DNA er fragmenteret, og den gennemsnitlige afstand mellem mutationer er stor, kan hver mutation analyseres ved en uafhængig test (3). Følsomheden af en analyse afhænger af mængden af kræftrelateret DNA, effektiviteten af sekvensanalysen af kræftrelateret DNA og antallet af analyserede mutationer (3).

Frit cirkulerende tumor DNA (ctDNA), RNA og protein frigøres fra kræftceller ved celledød, såsom apoptose eller nekrose, og ctDNA cirkulerer i blodet. Ændringer i ctDNA ligner ændringer, som er påvist i tumorvævsprøver, så test af ctDNA er et ikke-invasivt alternativ til test af vævsbiopsier. At tage en vævsbiopsi kan være risikabelt, vanskeligt at udføre og smertefuldt for patienten. Endvidere stammer ctDNA fra hele kræftknuden, medens en vævsbiopsi er begrænset til det sted, hvor biopsien er taget. Den flydende biopsi er derfor mere repræsentativ for kræftcellen. Ændringer i ctDNA kan være punktmutationer, ombytninger af sekvenser, amplifikationer og variationer i antallet af genkopier.

ctDNA-niveauet hos raske ligger typisk på 5-10 ng/ml plasma, medens niveauet hos individer med kræft ligger 50 gange højere (3). Test for typen og mængden af ctDNA kan også bruges til at følge, hvordan et individ responderer på en behandling. Traditionelt følges en behandling ved at måle størrelsen af en kræftknude, hvilket kræver, at kræftknuden har en vis størrelse. Flydende biopsier stammer almindeligvis fra blod, men der er også udviklet analyser på basis af urin, cerebrospinal væske og spyt (4). Analyse af cerebrospinal væske kan f.eks. bruges til at analysere forekomsten af ctDNA fra kræft i hjernen (4).

Flydende biopsier til påvisning af én type kræft

De seneste par år er der udviklet metoder til at analysere tidlig forekomst af én type kræft. Tidligere test var som regel rettet mod ældre stadier af kræft, men det er selvfølgelig mere optimalt at kunne påvise tidlige stadier, hvorved der hurtigere kan udføres operation eller gives medicinsk behandling. Test til at lokalisere ældre stadier af kræft er især blevet anvendt til at følge, hvordan en patient reagerede på en behandling (6). Ældre kræftknuder afgiver flere døde celler og er dermed lettere at påvise.

ctDNA-analyser til tidlig påvisning af kræft er svære at standardisere, da mængden af mutant DNA fra kræftceller varierer meget i de tidlige stadier (6). Aldersbestemt akkumulering af kræftrelaterede mutationer er også en udfordring ved påvisning af tidlige stadier af kræft (6). En meget stor gruppe af internationale forskere har udformet en ctDNA-analyse af udviklingen af de tidlige stadier af lungekræft (5).

Flydende biopsi til påvisning af flere kræfttyper ved én analyse

Det er for nyligt lykkedes en stor international forskergruppe at frembringe en test baseret på én blodprøve til påvisning af otte kræfttyper (1). Ved udvikling af testen har forskerne vurderet adskillige hundreder gener samt 40 proteinmarkører, der er relateret til kræft. Med et så stort antal kræftmarkører er risikoen for at få falsk-positive målinger stor. Ved falsk-positive målinger kommer man til at erklære raske personer for syge, og man skaber unødig bekymring. Det lykkedes forskerne at skære antallet ned til 16 gener og 8 proteinmarkører (1). Proteinmarkører er nødvendige til lokalisering af den primære kræftknude, da de samme genmutationer kan forekomme fra flere kræfttyper (1). Til analyse af de store antal kræftrelaterede mutationer brugte forskerne data fra over 30 års forskning i kræftgenetik.

Med det relativt lille panel af markører opnåede forskerne en specificitet (nøjagtighed) for kræft på 99% (1). Udover at testen blev mere specifik, blev den også billigere, sådan at prisen kan konkurrere med andre diagnosticeringsmetoder. Forskerne har døbt testen CancerSEEK.

Med det relativt lille panel af markører opnåede forskerne en specificitet (nøjagtighed) for kræft på 99% (1). Udover at testen blev mere specifik, blev den også billigere, sådan at prisen kan konkurrere med andre diagnosticeringsmetoder. Forskerne har døbt testen CancerSEEK. Testen blev afprøvet på 812 raske personer, og her fremkom kun 7 falsk-positive målinger (1). Det er et usædvanlig højt antal raske personer, der er blevet undersøgt for at sikre, at specificiteten er høj. Testen blev evalueret på 1005 metastase-frie patienter med trin I-III kræft i æggestok, lever, mave, bugspytkirtel, spiserør, endetarm, lunge eller bryst. Den samlede følsomhed eller evnen til at finde kræft var i gennemsnit 70%, hvilket dækker over 98% for æggestokkræft til 33% for brystkræft.

For de fem kræfttyper, hvor der ikke findes en screeningstest, nemlig kræft i æggestok, lever, mave, bugspytkirtel og spiserør, lå følsomheden fra 69% til 98% (1). CancerSEEK-resultater for 153 patienter, hos hvem ctDNA kunne påvises i signifikante niveauer, blev sammenlignet med påviste mutationer i kræftvæv. Ved denne test var mutationer i ctDNA i blodet identisk med mutationer i den primære kræftknude i samme individ i 138 tilfælde (90%) af de 153 tilfælde. Denne gode overensstemmelse mellem mutationer i ctDNA i blod og mutationer i den primære kræftknude var tydelig for alle 8 kræfttyper og lå fra 100% i æggestok til 82% ved mavekræft (1).

Testen skal afprøves på langt flere patienter. Der er behov for flere vurderinger af nøjagtigheden og pålideligheden af testen. Men lykkes det at få en tilstrækkelig sikker test, mener Niels Kroman, at det er et meget stort fremskridt inden for kræftområdet.

Uden klinisk viden om patienten kunne kræftpåvisningen med CancerSEEK lokaliseres til 2 mulige anatomiske steder i 83% af patienterne. I 63% af patienterne kunne kræften lokaliseres til et enkelt organ (1). Denne evne til at forudsige, hvilket organ kræftknuden befinder sig i, bygger især på de valgte proteinmarkører (1). Lokalisering af kræftknuden er afgørende for, at kræften kan findes og fjernes ved operation. Testen er nem at udføre og kan blive udført, når der alligevel skal tages blodprøver. Tidlig påvisning af kræft kan gøre det muligt at fjerne kræftknuden ved operation/starte en kræftbehandling tidligere.

Danmark følger med på sidelinjen

Under et interview 19. januar 2018 har cheflægen hos Kræftens Bekæmpelse, professor Niels Kroman, udtalt sig meget positiv om den lovende CancerSEEK-test, men der er er lang vej endnu, mener Niels Kroman (7). Testen skal afprøves på langt flere patienter. Der er behov for flere vurderinger af nøjagtigheden og pålideligheden af testen. Men lykkes det at få en tilstrækkelig sikker test, mener Niels Kroman, at det er et meget stort fremskridt inden for kræftområdet. Niels Kroman mener, at testen nok kun skal anvendes på personer over 50 år, hvor det erfaringsmæssigt sætter ind med flere kræfttilfælde (7).

Cheflægen hos Kræftens Bekæmpelse, professor Niels Kroman.

Perspektivering

Hvis CancerSEEK-metoden overlever grundige undersøgelser af nøjagtigheden og pålideligheden af testen, vil testen kunne håndteres af praktiserende læger, som sender blodprøverne fra en patient til analyse på et egnet laboratorium. Hvis testen viser sig at være positiv, kan lægen henvise patienten til en kræftafdeling på et hospital, hvor de har speciale i at udrede den kræftsygdom, som der er mistanke om, at patienten har. Ved et sådan forløb kan en patient få en målrettet behandling meget hurtigt.

Kilder

  1. Cohen, J.D. m.fl. (2018), Science, release 18 January 2018, ” Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test”, doi:10.1126/science.aar3247
  2. Phallen, J. m.fl., (2017), Sci. Transl. Med., 9, eaan2415, ”Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA”, doi:10.1126/scitranslmed.aan2415
  3. Butler, T.M. m.fl. (2017), Current Opinion in Genetics & Development, 42, 14-21, “Circulating-tumor DNA as an early detection and diagnostic tool”, doi:10.1016/j.gde.2016.12.003
  4. Bardelli, A. & Pantel, K. (2017), Cancer Cell, 31, 172-179, “Liquid biopsies, What we do not know (Yet)”, doi:10, 1016/ ccell.2017.01.002
  5. Abbosh, C. m.fl. (2017), Nature, 545, 446-451, “Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution”, doi:10.1038/nature22364
  6. Heitzer, E. m.fl. (2017), npj Precision Oncology, 1:36, “The potential of liquid biopsies for early detection of cancer”, doi:10.1038/s41698-017-0039-5
  7. Foghsgaard, L. (2018), Politiken, 19. januar, 2018, sektion I, side 8, “Ny test kan spore kræft, før man for alvor bliver syg”